医源性早产胎膜早破（iPPROM）是侵入性胎儿医学干预措施的致命弱点。根据手术类型的不同，医源性早产胎膜早破的发生率超过30%，这会导致绒毛膜羊膜炎、早产、围产期死亡率以及存活者患病几率增加。以往大多数治疗早产胎膜早破的尝试主要集中在通过使用各种组织密封剂来修复胎膜缺损，这些密封剂经宫颈内或羊膜腔内应用，但成功率有限。对临床医源性胎膜缺损的病理学研究表明，伤口主动愈合的倾向较低。此外，目前现有的封闭胎膜缺损的方法在体外和体内实验中都未能证明存在非常活跃的修复过程。最近，我们提出了一种基于人羊膜细胞外基质（ECM）支架支持羊膜细胞向内生长的治疗早产胎膜早破的新组织工程方法。细胞外基质在维持体内平衡和引导再生方面起着重要作用。羊膜细胞外基质已成功应用于眼科，用于治疗角膜烧伤。研究表明，它可促进上皮再形成，减轻炎症，从而抑制纤维化。出于多种原因，合成替代品更受青睐：它们更便宜且更容易获得，可根据特定应用进行定制，并且不存在感染、转导或产生免疫反应的风险。这类材料的种类繁多，并且已成功应用于组织工程的不同领域。其中一种产品是DegraPol（材料系，聚合物研究所，瑞士联邦理工学院，苏黎世，瑞士）鼎冠配资，这是一种具有弹性、可降解的聚酯氨酯支架，可通过静电纺丝加工成微纤维膜的形式，其纳米尺寸模拟了天然存在的细胞外基质。它的优点是，通过改变聚合物中可结晶嵌段的含量，其弹性模量可在10-800兆帕之间变化，并且其断裂伸长率高于200%。
展开剩余93%本研究的目的是评估与DegraPol相比，工程化天然羊膜支架（AS）在封闭医源性胎膜缺损方面的功效，并通过组织学记录所诱导的愈合反应。
一、材料与方法
01. 天然兔羊膜支架的工程构建与结构分析
在妊娠第23天（足月约31-32天），在无菌条件下从一只母兔的所有羊膜囊中收集羊膜贴片，以构建天然羊膜支架，具体方法如先前详细描述的那样。将四个工程化兔羊膜支架和一片兔羊膜作为对照，先固定在含磷酸盐缓冲液的4%多聚甲醛溶液中，然后分别在含3%蔗糖的磷酸盐缓冲液中处理24小时，之后保存在70%乙醇中，直至进行处理并包埋在石蜡中。用苏木精-伊红（HE）染色。将三个工程化兔羊膜支架和三片对照兔羊膜固定在2.5%戊二醛中，并用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。用一系列梯度浓度的乙醇脱水后，进行临界点干燥。将样品固定并进行金-钯溅射处理以实现表面导电性，然后用蔡司SUPRA进行扫描电子显微镜分析。
图1 DegraPol的扫描电镜图片
DegraPol是一种具有弹性、生物相容性且可降解的合成支架，其扫描电镜图片显示了一个由随机或部分有序排列的纤维组成的网状结构，这些纤维直径约为10微米，在交叉点处固定；放大倍数：×500。
02. DegraPol
我们使用了一种静电纺丝的聚酯氨酯，它由聚((R)-3-羟基丁酸)-二醇的可结晶嵌段以及聚(ε-己内酯-共-乙交酯)-二醇的嵌段通过二异氰酸酯连接而成。其膜大致可描述为由随机或部分有序排列的纤维组成的网状结构，这些纤维直径约为10微米，在交叉点处固定（图1）。在pH值为7、温度为37°C的缓冲水溶液中，4周后它大约会水解50%。在本实验中，选择了弹性模量最低（约10兆帕）的一种，因为这最接近已知的人类早产羊膜的杨氏模量。
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03. 胎膜缺损的兔模型
另外选取十只已确定怀孕时间的新西兰母兔，在妊娠第23天进行手术。术前先肌肉注射氯胺酮（25毫克/千克）、赛拉嗪（6毫克/千克）和丁丙诺啡（0.02毫克/千克）进行预麻醉。然后用异氟醚（1%至1.5%）在氧气流速为1.5升/分钟的条件下进行麻醉。术前肌肉注射醋酸甲羟孕酮（9毫克/千克）进行宫缩抑制，并肌肉注射青霉素G（300,000单位）作为预防性抗生素。将母兔仰卧放置，在持续抽吸下剃毛，用聚维酮碘消毒，并用无菌手术巾覆盖。在无菌条件下使用显微外科器械对子宫和胎膜进行干预。通过腹部中线切口暴露子宫，对妊娠囊进行计数并编号。将卵巢端的囊随机分配到接受兔羊膜支架（n = 10）或DegraPol（n = 10）治疗的组中。每只兔子随机选择一个囊作为阳性对照（n = 10）。其余的囊作为阴性对照。
在切开子宫肌层和绒毛膜以便能够正确穿刺羊膜囊后，用14号（2.1毫米）针头制造一个胎膜缺损，并通过抽吸羊水来确认位置正确。如果该囊被分配到羊膜支架组，则用聚丙烯6-0缝线穿过天然支架并将其堵塞在缺损处，以固定支架。在DegraPol组中，用聚酯氨酯塞覆盖胎膜缺损处，并按上述方法固定。在阳性对照组中，胎膜不进行封闭。用单独的Prolene 6-0缝线显微缝合子宫肌层。将子宫复位后，用聚乳酸2-0缝线缝合筋膜，用3-0皮内尼龙缝线缝合皮肤，分层关闭腹部。在手术室恢复后，将动物送回笼子，允许自由进食和饮水。
图2 光学显微镜图片
光学显微镜图片显示，A为工程化兔羊膜支架，与E未处理的兔羊膜相比，其表面细胞已完全去除。HE染色切片显示，B兔羊膜支架无细胞，而F兔羊膜有细胞。扫描电镜图像证实，C、D羊膜支架中无细胞，但G、H其超微结构与兔羊膜中的一样得以保留。放大倍数：A和E：×10；B和F：×40；C：×1000；D：×9980；G：×1020；H：×10,050。
在妊娠第30天，给母兔注射T61进行安乐死，以便进行二次剖腹探查。在子宫系膜对侧切开子宫肌层，然后用显微外科器械轻轻分离，以暴露穿刺过的和作为对照的囊。通过针头抽吸检查羊水是否存在，并通过使用26号针头经与先前穿刺部位相对的胎膜向羊膜腔内注射用亚甲蓝染色的生理盐水，检查是否有渗漏，从而验证宏观羊膜的完整性。为了能够“整块”采集最初的创伤部位，用至少距离穿刺点1厘米的4针缝线将胎膜固定在下面的子宫肌层上。将标本固定在含磷酸盐缓冲液的4%多聚甲醛溶液中，并按上述方法进行处理，以用于进一步的组织学和免疫组织化学研究。
所有动物的处理均符合当前的动物福利准则，并且这些实验已获得比利时鲁汶天主教大学医学院动物实验伦理委员会的批准。
04. 入口部位的组织学和免疫组织化学
在入口部位制作4微米厚的切片，并用HE和Movat染色。后者将胶原纤维染成黄色，将基质染成蓝色。此外，针对Ki-67核抗原进行免疫组织化学染色，Ki-67核抗原与细胞周期的所有活跃阶段相关，在静止细胞中不存在，使用单克隆小鼠抗人Ki-67抗体（克隆MIB-1）。使用过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠免疫球蛋白G和M进行检测，并用3,3'-二氨基联苯胺染色。此外，还进行了双重染色，使用单克隆小鼠抗人波形蛋白抗体（克隆V9），该抗体主要标记间充质来源的细胞，以及EPOS单克隆小鼠抗人细胞角蛋白抗体（克隆MNF 116），这是一种上皮细胞系标记物，基于一种惰性聚合物主链分子，一抗和可被3-氨基-9-乙基咔唑染色的辣根过氧化物酶与之化学连接。使用山羊抗小鼠抗体检测小鼠抗人波形蛋白抗体，并用单克隆小鼠碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶抗体和固蓝染色。
05. 图像分析鼎冠配资
主要观察指标为支架的整合情况、上皮再形成情况、增殖指数以及支架的多形核细胞浸润情况。由于两种支架在组织学和免疫组织化学方面看起来完全不同，因此无法进行盲法分析。首先，通过一种半定量的、经验性的描述性方案对支架的整合情况进行评分，如下：（+）当在组织学切片上能识别出支架，但支架未与周围组织整合时；（++）当支架与胎膜整合时；（+++）当胎膜似乎通过上皮再形成得以修复时。其次，使用与配备数码相机的显微镜相连的图像分析系统对支架的上皮再形成情况进行定量评估。在10倍光学显微镜视野下手动描绘新上皮和支架剩余未覆盖的表面，每个支架进行3次测量。第三，通过计算Ki-67阳性细胞核的数量，并将其除以高倍视野（HPF；40倍）中的细胞核总数来计算增殖指数（PI），分别在羊膜支架（AS）或DegraPol及其紧邻区域进行计算，对于阳性对照则在创伤部位的边界处进行计算。分别对胎膜、母体蜕膜和子宫肌层在界面处的区域进行评分，每个层次计数3次。通过在高倍视野中计数所有细胞来确定支架中的细胞向内生长情况。最后，如上述对Ki-67阳性细胞的计数方法一样，在高倍视野中分别对羊膜支架（AS）组或DegraPol组以及阳性对照组中的多形核细胞进行计数。当3次计数的平均值显示在评估区域内每高倍视野中有超过100个多形核细胞时，定义为存在显著的多形核细胞浸润。
06. 统计学分析
结果以平均值±标准误（mean±SEM）表示。使用统计软件进行曼-惠特尼U检验（Mann-Whitney U test）统计分析。显著性水平设定为P < 0.05。
二、结果
兔羊膜支架（AS）的光学显微镜图像（图2A）清楚地显示没有残留细胞，而在未处理的兔羊膜中明显存在大量细胞（图2E）。兔羊膜支架的HE染色（图2B）和扫描电镜分析（图2C和D）证实其已完全去细胞化，这与未处理的兔羊膜形成对比（图2F至H）。羊膜支架的超微结构完整性及其胶原纤维的三维网络被发现完全保留，呈现出波浪状结构（图2D）。
所有接受手术的母兔均在手术中存活，在处死时未发现有胎儿疝入母体腹腔。在切开子宫肌层并打开妊娠囊后，未观察到羊膜内粘连或羊膜带。进一步的结果数据见表1。两种支架组的胎儿存活率均为90%，与阳性和阴性对照组无差异。在所有9个羊膜囊中，均能追踪到兔羊膜支架，而在9个羊膜囊中，有7个能追踪到DegraPol。在1个羊膜囊中，发现DegraPol在羊膜腔内自由漂浮，并将其收集并进行处理。在另一种情况下，未发现DegraPol。阴性对照组中98%存在羊水，而阳性对照组中仅17%存在羊水（P < 0.001）。与阳性对照组（17%）相比，仅在DegraPol组（78%）中羊水的存在率显著更高（P < 0.05），而在羊膜支架（AS）组（67%）中，羊水存在率与阳性对照组相比无显著差异（P = 0.07） 。
表1.研究组的结果
通过HE染色和Movat染色均证实了兔羊膜支架的存在（图3A）。在更高的放大倍数下，兔羊膜支架总是能很好地与周围组织整合。在9个样本中的1个样本切片区域中，兔羊膜支架甚至通过上皮再形成完全恢复了胎膜的完整性（图3B和C）。兔羊膜支架中良好的细胞向内生长情况表现为每高倍视野中有93±8个细胞，尤其在与上皮再形成率高（52.5%±6.5%）和增殖指数（PI）高（0.47±0.03）的界面处（图3D）。羊膜支架（AS）中存在少量多形核细胞（每高倍视野6.8±2.8个），但在兔羊膜支架中未观察到任何显著的多形核细胞浸润或异物巨细胞。在能追踪到DegraPol的7个案例中，只有6个案例中该产品能很好地与胎膜整合（图3E和F）。在2个局部未发现DegraPol的案例中，发现了一个较大的缺损，看起来与任何阳性对照相似。在所有阳性对照组中，多形核细胞数量为零或极少（表2）。与兔羊膜支架相比，处理的8个DegraPol支架显示出更高的细胞向内生长数量（每高倍视野151±18个细胞；P < 0.01）和多形核细胞数量（每高倍视野13.3±2.4个；P < 0.001）。在所有8个DegraPol部位，在DegraPol残余物周围发现了大量嗜酸性粒细胞和单核细胞，夹杂着稀疏的异物巨细胞。与阳性对照组（每高倍视野1.6±0.5个；表2）相比，我们在羊膜支架（AS）组（每高倍视野6.6±1.4个；P < 0.05）和DegraPol组（每高倍视野4.4±0.8个；P < 0.05）的胎膜中发现了更多的多形核细胞。与兔羊膜支架组相比，DegraPol的上皮再形成率（11.6%±2.6%）和增殖指数（PI）（0.28±0.04）更低（分别为P < 0.001和P < 0.001）（图3G和H）。此外，增殖指数表明，与阳性对照组相比，两种支架周围的蜕膜增殖增加，子宫肌层的增殖显著增加（表2）。
图3. 封堵部位的代表性切片
封堵部位的代表性切片，A - D为兔羊膜支架（AS），或E - H为DegraPol（Degr）。A，Movat染色：兔羊膜支架染成黄色至浅绿色，且很好地整合在胎膜（FM）和子宫肌层（M）中；B，与A为同一区域，波形蛋白（蓝色）和细胞角蛋白（红色）的双重染色；C，D，是感兴趣的放大区域。C，*指向上皮层（°）下方的间充质细胞。D，Ki - 67将增殖细胞染成棕色（*）。兔羊膜支架中存在的Ki67阳性细胞比H中DegraPol的更多。E，F，HE染色显示DegraPol（¢）在胎膜（FM）缺损区域的整合情况。G，H，与F为同一区域。G，波形蛋白和细胞角蛋白的双重染色，上皮再形成很少（°）。H，Ki - 67阳性细胞；（*）染成棕色。放大倍数：A，B和E：×10；C - D和F - H：×40。
表2. 兔羊膜支架（AS）、DegraPol或胎膜缺损（阳性对照）周围的胎膜（FM）、蜕膜（D）和子宫肌层（M）中的增殖指数和每高倍视野（HPF）多形核细胞数量
三、评论
在本研究中，我们首次应用组织工程技术来封闭医源性胎膜缺损。为此，我们使用了兔模型并构建了天然兔羊膜支架（AS）。我们将其封闭胎膜缺损的功效与通过静电纺丝制成的合成聚酯氨酯支架进行了比较，这种合成支架尽可能地接近内源性细胞外基质（ECM）的特征，且其机械性能最接近人类羊膜。在7天的研究期内，天然羊膜支架比DegraPol保存得更好。两个治疗组的宏观胎膜完整性相当。羊膜支架的羊膜一侧大量覆盖着上皮细胞，且其周围几乎没有炎症迹象。在少数情况下，DegraPol会移位，并且与周围组织的整合程度较差。上皮再形成的情况少得多，并且存在轻微的局部炎症迹象。
我们之前在胎膜伤口愈合的研究中使用过兔模型。这种低等物种是一种经济实惠的模型，饲养要求低，产仔数量多。然而，胎膜与蜕膜和子宫肌层的关系与人类或非人灵长类动物中的情况有很大不同。尽管如此，在大多数情况下，未经处理的手术诱导的胎膜缺损会持续存在，最终导致羊水过少及其后果。这一观察结果在本研究中得到了证实，对照囊没有显示出任何自发愈合的倾向，并且炎症有限或不存在。
在这项研究中，有1个案例显示羊膜支架在1周内通过上皮再形成使胎膜恢复了完整性，其他所有支架也显示出了有希望的上皮再形成情况。因此，可以推测，在更长的妊娠期后，可能会实现胎膜上皮再形成的增加或完全愈合。其他可用于进一步研究胎膜愈合的动物模型有绵羊模型或灵长类动物模型，它们的妊娠期分别为145 - 150天或165天。
在缺乏有效的自发愈合过程的情况下，我们和其他研究人员试图增强这一过程。为此，曾使用封闭剂或或多或少的固体试剂来“堵塞”胎膜缺损，这可能会阻止羊水渗漏。然而，其基本原理更多的是这些试剂可以作为积极的上皮再形成过程的底物或基质。基质在细胞粘附、迁移和增殖中起着重要作用。这就产生了“接触引导”理论，该理论指出，由于合成或生物来源的、同源或异源甚至是异种来源的底物的化学、结构和/或机械特性，细胞增殖和分化可以在优先方向上得到促进。实际上，人类羊膜细胞外基质已被用于此目的，用于治疗角膜缺损或大面积烧伤的患者，或者最近被用作周围神经再生的支持材料。羊膜细胞外基质具有结构蛋白，即各种胶原蛋白，以及碳水化合物成分透明质酸，这些对组织弹性很重要，还有较小的蛋白聚糖，如双糖链蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和纤连蛋白以及层粘连蛋白，它们能促进上皮再形成并有助于细胞粘附。然而，羊膜细胞外基质尚未被用于增强羊膜上皮伤口愈合，这正是本研究中测试的假设。为此，我们如先前对人类羊膜支架的描述那样，构建了一种天然的、异源的兔羊膜支架。我们能够证明这些支架可以从新鲜采集的羊膜中获得，并且是无细胞的。这些羊膜支架可以通过手术操作来封闭针头诱导的胎膜缺损。在这个极具挑战性的模型中，由于胎膜与子宫壁之间的关系松散，这些支架像先前对胶原塞的描述那样通过手术固定，并且没有移位。在10天的研究期内，这些支架引发了轻微的炎症反应，并且在堵塞物的羊膜一侧实现了高度的上皮再形成。
在另一个治疗组中，我们使用了一种合成材料，这种材料可以被制造得与胎膜的物理特性相匹配。在9个案例中有2个案例中该材料发生了移位，但在其他案例中，它在物理上对羊膜囊的封闭效果与羊膜支架一样好。然而，宿主的反应有所不同。观察到了异物反应，巨噬细胞和异物巨细胞试图清除聚合物碎片，这是DegraPol降解过程中的一种已知现象，且对细胞生长或功能没有任何负面影响。此外，在DegraPol内部可以看到更多的细胞；然而，与异源羊膜支架相比，其上皮再形成和增殖的程度较低。这种合成材料可能缺乏细胞粘附和生长因子或其他炎症介质，从而决定了宿主的反应。例如，DegraPol将缺乏单细胞粘附分子和生长因子，如表皮生长因子、角质形成细胞生长因子、肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，这些都是羊膜细胞外基质的已知成分。另一方面，合成支架的优点是它们没有（理论上）传播未知病毒或朊病毒病原体的风险，并且它们可以以不受限制的方式进行构建，且成本和价格合理。
在大多数关于使用各种胶原蛋白和明胶海绵塞的研究中，治疗部位的组织学情况无从得知。然而，对于牛胶原蛋白塞，显微镜检查显示仅胎膜被困在塞子和子宫肌层之间，没有上皮再形成的迹象。与胶原蛋白直接接触的部分胎膜显示出退化的迹象。此外，还可见大量异物细胞浸润到胶原纤维中。含有转化生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的异种生物活性基质（bioSIS），导致塞子周围的蜕膜和子宫肌层中的增殖指数（PI）增加。在胎膜和蜕膜中发现了大量多形核细胞，并且在1个案例中我们发现了一条羊膜内纤维带。所有这些都表明存在炎症和异物反应。当用人羊膜封闭兔胎膜缺损时，观察到了强烈的异物反应，伴有大量嗜酸性粒细胞。鉴于此，使用天然的无细胞支架似乎是合理的。在本实验中，我们使用了同源的无细胞材料，以避免对其他物种的细胞或胶原蛋白产生任何免疫反应。在移植同源羊膜支架（AS）后，既未发现异物细胞，也未发现多形核细胞浸润，这表明其具有良好的相容性。
总之，用天然羊膜或可降解合成支架封闭胎膜缺损时，天然羊膜支架表现出优越性，在1周内即可实现大量上皮再形成。到目前为止，这是所测试过的最有效的胎膜封闭技术。进一步的研究应该评估这些重建胎膜的机械性能以及在高等物种中的功效。
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